在光學領域，像差問題的存在影響著該領域的技術應用。像差會使光波前發(fā)生形變，降低成像的信噪比和分辨率，甚至產生贗像或無法獲得有意義的圖像，該問題特別對雙光子成像影響

 　　在光學領域，像差問題的存在影響著該領域的技術應用。像差會使光波前發(fā)生形變，降低成像的信噪比和分辨率，甚至產生贗像或無法獲得有意義的圖像，該問題特別對雙光子成像影響嚴重。因此解決像差問題，實現活體，例如小鼠大腦皮層深層區(qū)域的高質量成像成為光學成像發(fā)展中亟待解決的課題。

 　　熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。細胞中有些物質，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光；另有一些物質本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。

 　　像差問題一直困擾著光學領域的工作者。像差會使光波前發(fā)生形變，不僅降低成像的信噪比和分辨率，使得很多時候我們只能“霧里看花更甚者，產生贗像，或無法獲得有意義的圖像。像差問題對雙光子成像的影響尤為嚴重，因為在那里，熒光信號對入射光強度的依賴是平方關系，一旦入射光波前形變，不僅聚焦強度大幅下降，成像分辨率也急劇惡化。因此，如何解決像差問題，實現活體，例如小鼠大腦皮層，深層區(qū)域的高質量成像成為光學成像發(fā)展中最具挑戰(zhàn)性的問題之一。

 　　近日，來自美國霍華德。休斯醫(yī)學研究所的研究者與來自中科院上海光機所的研究人員合作，成功將一種新的自適應光學的方法和雙光子顯微鏡結合，研發(fā)成功一種新的自適應光學雙光子熒光顯微鏡。通過校正活體小鼠大腦的像差，在視覺皮層的不同深度處均獲得了提高數倍的成像分辨率和信號強度，大大改進了成像質量，使得原來在活體鼠腦中不可見或者模糊的細節(jié)變得清晰可見。這一新的自適應光學方法，首次使得在活體小鼠深層區(qū)域成像中獲得近衍射極限的成像分辨率成為現實。

 　　在該自適應光學雙光子熒光顯微鏡中，研究者將空間光位相調制器光學共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被獨立控制。同時，利用數字微陣列光處理器，以不同的頻率同時調制其中一半子區(qū)域的入射光強度，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”。來自所有子區(qū)域光束會在焦點處會聚干涉，通過監(jiān)測焦點激發(fā)的雙光子信號隨時間的變化情況，并進行傅里葉變換分析，可以“分解”得到被調制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻信息，從而可以實現對一半子區(qū)域波前的并行測量。對另一半子區(qū)域重復這一測量過程，從而獲得整個入射波前的信息并進行校正。

 　　將高清晰圖像與使用簡便的系統(tǒng)，以及廣泛的寬視野顯微鏡應用相結合。研究者使用該顯微鏡除了可以完成從高速成像到TIRF的日常試驗之外，還可以獲得超清的影像。獨特的全內反射熒光功能可在多色實驗過程中，通過改變波長以智能方式彌補穿透深度，對消散的視野方向進行全自動校準和選擇，以確保獲得質量最佳的全內反射熒光圖像與可靠的實驗數據。動態(tài)掃描儀可精確定位激光束，并決定消散視野的準確穿透深度。使用一些特殊的熒光軟件如徠卡AF7000熒光軟件可全面控制全內反射熒光系統(tǒng)，包括校準與所有顯微鏡功能，確保減少培訓的時間以盡快投入到科學研究中。

 　　該方法耗時很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正，無需復雜的計算，適用于任何標記密度和標記類型的樣品。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內的成像質量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物、醫(yī)學問題提供了可行性方案。